I principali batteri del microbiota intestinale dell’uomo
La descrizione completa del microbiota umano e il suo rapporto con la salute e la malattia si sono già dimostrati una delle principali sfide nel XXI° secolo. In effetti, l’elenco delle pubblicazioni per anno su tale argomento si è espanso notevolmente nell’ultimo decennio e già nel 2011 sono state contate in letteratura citazioni in numero quattro volte maggiore rispetto al 2005.
Recenti evidenze hanno indicato che i batteri fecali coltivabili rappresentano solo una frazione di quelli effettivamente presenti nell'intestino. L'applicazione delle nuove tecnologie, indipendenti dalla coltura, ha anche rivelato che la diversità della flora intestinale fecale era considerevolmente maggiore del previsto. Negli studi la proporzione delle specie non descritte variava dal 30 al 90%. Alcune sequenze di rRNA 16S hanno, poi, indicato la presenza di specie non descritte strettamente connesse a quelle note e di altre specie o generi con lontana parentela con batteri noti. Tutto ciò forse in ragione del gran numero di substrati fermentabili disponibili nel tratto gastrointestinale. In effetti, i principali elementi disponibili per i batteri del colon umano sono i carboidrati alimentari sfuggiti alla digestione nel piccolo intestino. In particolare, sono amidi resistenti, fibre alimentari, come cellulosa, emicellulosa, pectina, inulina, zuccheri non assorbiti e polialcoli. Tuttavia, anche le proteine della dieta e quelle degli enzimi pancreatici e delle secrezioni gastrointestinali possono contribuire in una certa misura al pabulum dei batteri intestinali. Inoltre, anche il muco prodotto dall'ospite e le cellule epiteliali esfoliate rappresentano altri substrati potenziali.
In effetti, la fermentazione dei polimeri complessi, quali i polisaccaridi e le proteine, richiede nel colon la cooperazione di differenti gruppi di popolazioni microbiche. La suddivisione inizia con la depolimerizzazione dei carboidrati complessi e delle proteine, dando origine ai composti mono e oligomerici che, a loro volta, possono subire un’ulteriore frammentazione sino agli SCFA (short-chain fatty acids), come l’acetato, il propionato, il butirrato con formazione anche di anidride carbonica e idrogeno molecolare. L’acido lattico, il succinico, l’etanolo, e il formiato costituiscono gli importanti composti intermedi, anch’essi degradati a SCFA, CO2 e H2. Le proteine sono segmentate in peptidi e aminoacidi, la cui fermentazione provoca anche la formazione di SCFA, CO2 e H2. Inoltre, si formano acidi grassi a catena ramificata, ammoniaca, solfuro d’idrogeno, ammine, fenoli, indoli e mercaptani.
Gli studi sulle caratteristiche della presenza dei germi del microbiota intestinale umano riportano il dominio dei cinque phyla batteri: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria e Verrucomicrobia e un Archaea, l’Euryarchaeota. I gruppi meno prevalenti sono tra i cianobatteri, i Fusobacteria, le Lentisphaerae, le spirochete e i TM7. I Firmicutes sono un phylum di batteri gram positivi che contengono generi significativi, compresi il Ruminococcus, il Clostridium, il Lactobacillus, di cui diversi ceppi sono probiotici, l’Eubacterium produttore di butirrato, il Faecalibacterium e la Roseburia. Nella famiglia delle Batteroidacee i Bacteroides, la Prevotella e lo Xylanibacter degradano una varietà di glicani complessi. Gli Attinomiceti phylum comprendono la Collinsella e il Bifidobacterium, che contiene ceppi probiotici. I Proteobacteria comuni sono l’Escherichia della famiglia delle Enterobacteriaceae e il Desulfovibrio, che include batteri che riducono il solfato. I Verrucomicrobia sono stati di scoperta più recente e comprendono gli Akkermansia, specializzati nella degradazione del muco. Gli Euryarchaeota contengono prevalentemente il Methanobrevibacter, coinvolto nella continuazione della metanogenesi intestinale.
Le tecniche filogenetiche di DNA microarray, basate sulla microibridazione contemporanea di migliaia di specifici frammenti di DNA come supporto solido recante una successione ordinata di migliaia di microscopici spot, contenenti ognuno poche picomoli di uno specifico frammento con una precisa sequenza, sono tra le principali tecniche molecolari complete che consentono analisi di alta produttività degli ecosistemi microbici. Possono essere anche utilizzate per la tipizzazione del ceppo, della determinazione della diversità e dell'analisi della funzionalità microbica. Questi microarray filogenetici sono, nella maggior parte dei casi, basati sulla piccola subunità ribosomiale RNA (SSU rRNA) del gene. Possono, pertanto, essere utili per la caratterizzazione della composizione e delle dinamiche del microbiota intestinale umano. In tal modo, più del 60% delle diversità attualmente note dei filotipi della flora intestinale si è rilevato con le sequenze geniche 16S rRNA. Invece, meno del 40% è stato dimostrato dai processi di coltura. Peraltro, l'analisi comparativa con altre metodologie, come il pirosequenziamento, dimostra che questa tecnica è robusta e altamente riproducibile.
Pur tuttavia, utilizzando metodi di sequenziamento tradizionali, la stima delle comunità batteriche del microbiota è, invero, a causa del loro costo elevato molto impegnativa. Pertanto, l'attenzione si è spostata rapidamente verso sequenziamenti con tecnologie di più recente generazione. In effetti, la maggior parte dei batteri condivide alcune regioni nel gene 16S rRNA che si affiancano in più variabili segmenti. Questi, quindi, possono essere utilizzati come impronta digitale di determinate specie batteriche. La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction), comunemente nota con l'acronimo PCR, è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione, o meglio l’amplificazione dei frammenti degli acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. In tal modo, quindi, si possono ottenere in vitro molto rapidamente le quantità di materiale genetico necessarie per le successive applicazioni.
La PCR real time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), è un metodo di amplificazione e quantificazione simultanea del DNA. Essa è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza stabilita in un campione biologico, quantificando il DNA dopo ogni turno di amplificazione. Il DNA è amplificato e dopo ogni turno quantificato dalle reazioni a catena della DNA-polimerasi. I metodi comuni di quantificazione ricorrono all'uso delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il doppio filamento del DNA (ds) e con i suoi oligonucleotidi modificati, denominati sonde. Queste ultime, una volta ibridate con un DNA, diventano fluorescenti. Spesso, per quantificare i livelli di espressione degli specifici RNA, si usa combinare la PCR Retro Trascrizionale (RT-PCR), così che in una tipica reazione il prodotto si raddoppia a ogni ciclo dell'amplificazione. La retro-trascrizione, o trascrizione inversa, produce del DNA complementare a ogni singolo filamento, detto cDNA o complementary DNA, mantenendo i relativi rapporti inalterati di concentrazione delle diverse specie degli RNA. In tal modo, si rende possibile la misura dell'espressione relativa di un gene in un particolare momento, o in una cellula o in uno specifico tessuto. La combinazione di queste due tecniche è spesso denominata RT-PCR quantitativa.
Nei cicli finali, però, i substrati di reazione iniziano a scarseggiare e i prodotti della PCR a non raddoppiare. Così che, la curva tende ad appiattirsi. Il punto sulla curva in cui la quantità di fluorescenza comincia ad aumentare velocemente, solitamente alcuni scarti quadratici medi sopra la linea di base, è chiamato ciclo soglia o valore di Ct. Il diagramma del Ct sullo stampo del DNA è lineare. In tal modo, confrontando i valori del Ct fra reazioni multiple si può calcolare la concentrazione dell'acido nucleico che si vuole quantificare. Inoltre, la pendenza di questa linea offre anche una misura dell’efficienza della PCR. Si può effettuare una quantificazione assoluta delle concentrazioni degli specifici DNA o RNA, producendo una curva standard di calibrazione. In forma alternativa, una quantificazione relativa può ottenersi rapportando la loro quantità, rispetto a quella di un gene di controllo. In conformità a quanto riportato, può assumersi che la PCR real time rappresenta un innovativo sistema di rilevamento e di misurazione del DNA amplificato in tempo reale con riduzione del numero delle repliche necessarie alla determinazione di ogni campione. In tal modo, vengono anche superate tutte le manipolazioni successive all’amplificazione, potenziale motivo di alterazione dei risultati. In definitiva, nel confronto con le PCR tradizionali i vantaggi di precisione e d’intervallo di quantificazione risiedono nella possibilità di quantificare il DNA al ciclo soglia. Esso, in effetti, è sempre calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR in cui i reagenti sono ancora lontani dall’esaurimento e, quindi, con gli elementi di variabilità ridotti al minimo.
Lu Cheng dell’University of Helsinki – Finland e collaboratori, hanno proprio puntualizzato l’importanza della stima della composizione batterica di una comunità di un campione misto nei diversi contesti applicativi dei microbiologi. Hanno anche ribadito che essa era comunemente ottenuta con la reazione a catena della polimerasi di clustering amplificato delle sequenze geniche 16S rRNA (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 12, 5240–5249). Purtroppo, questi correnti metodi di clustering per l'analisi di queste sequenze dipendenti dalla tassonomica, come l’UCLUST, l’ESPRIT-Tree e il CROP, avevano due limitazioni:
1)la necessità di conoscenze specifiche, come l’esatta indicazione della
differenza tra una specie e l’altra,
2)l’impossibilità di separare specie strettamente correlate tra loro.
La prima limitazione caricava di un gravoso onere per il notevole sforzo necessario per selezionare i parametri appropriati. La seconda, invece, portava a una descrizione imprecisa della comunità batterica sottostante la composizione.
Sulla base di tali premesse, gli Autori per superare queste limitazioni proponevano un metodo probabilistico di stima della composizione della comunità batterica. Il metodo, secondo gli Autori, avrebbe richiesto scarse conoscenze specifiche con sola indicazione del numero massimo possibile dei cluster. Anche il loro metodo dimostrava la sua capacità di separare strettamente specie correlate in due esperimenti, nonostante gli errori del sequenziamento e delle variazioni individuali.
In conclusione, quindi, gli Autori hanno sviluppato un nuovo metodo per la rilevazione della comunità batterica sulla base di 454 dati di sequenziamento. Rispetto ai metodi tradizionali, hanno potuto determinare il numero delle specie batteriche automaticamente, mentre non era necessario alcun riferimento esterno di basi dei dati. Il metodo poteva anche essere utilizzato per altri problemi che richiedevano raggruppamento di grande quantità di sequenze del DNA. Era in grado, peraltro, di separare specie strettamente correlate negli OTU (operational taxonomic unit) indipendenti.
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